Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde die Morphologie der frühen Entwicklungsstadien von Uncinula necator (SCHW.) BURR., dem Erregers des Echten Mehltaus der Rebe, auf Vitis vinifera untersucht und die biochemischen Ereignisse charakterisiert, die der Penetration der Wirtszellen vorausgehen. Aufgrund früherer Penetrationsstudien an künstlichen Oberflächen wurde bisher eine rein mechanische Durchdringung von Cuticula und Epidermiszellwand angenommen. Allerdings scheinen cuticula- und zellwandabbauende Enzyme wie Cutinase für die Pathogenität anderer Echter Mehltaupilze von Bedeutung zu sein. Daher wurde in dieser Studie die Rolle cutinabbauender Enzyme wie Esterasen und Cutinasen im Infektionsprozeß untersucht. Innerhalb dieses Entwicklungsabschnittes wurde der zeitliche Verlauf der Adhäsion von Konidien und Keimlingen aufgenommen und in Bezug zu den auftretenden Keimstadien gesetzt.
Der zeitliche Verlauf der Konidienkeimung wurde auf Blattscheiben von V. vinifera unter denselben Bedingungen, bei denen Esteraseaktivität auftrat, untersucht. Bei einer Temperatur von 24°C begann sich nach weniger als 2 hpi ein Keimschlauch am Ende der Spore vorzuwölben, verdickte sich terminal (2,75 hpi) und reifte innerhalb von 3,5 hpi zu einem gelappten Appressorium. Mit dem Anstieg der Keimrate vergrößerte sich auch der Anteil von Konidien mit Appressorium. Innerhalb der ersten 10 h waren 70 % der Sporen gekeimt, 50 % der Koni-dien hatten ein Appressorium ausgebildet. In der Folge blieb die Anzahl gekeimter Konidien konstant. Mit dem Erscheinen der ersten Primärhyphen (14 hpi) und Sekundärhypyhen (18 hpi) setzte die Besiedlung des Wirtsgewebes ein. In parallel durchgeführten Adhäsionstests konnte gezeigt werden, daß sich Konidien vor dem Einsetzen der Keimung leicht von der Wirtsoberfläche abwaschen lassen. Zwischen 3 und 8 hpi erhöhte sich der Anteil haftender Keimlinge von 15 % auf ein Sättigungsniveau von etwa 70%. Vorbehandlung des Blattmaterials mit dem Esteraseinhibitor BIC führte zu keiner signifikanten Reduktion der Adhäsion.
In Kryo-REM-Untersuchungen war auf der Oberfläche keimender Konidien von U. necator eine retikuläre Struktur zu erkennen, während an Konidiophoren befindliche Konidien glatt erschienen. An der Kontaktzone von primären Appressorien und der Cuticula von V. vinifera bzw. Hordeum vulgare waren Ablagerungen extrazellulären Materials zu beobachten, die beim Ablösen der Sporen zum Teil auf der Wirtsoberfläche verblieben. Das Auftreten dieser Matrix in einem Stadium, in dem der Metabolismus des Pilzes auf die Reserven in der Spore beschränkt ist, legt nahe, daß es sich um einen essentiellen Vorgang handelt, der zu einem effektiven Anheften des Penetrationsorgans auf die Wirtsoberfläche führt. Diese Ablagerun-gen fanden sich auch auf künstlichen Oberflächen wie Glas und PVDF-Membranen.
Durch einen histochemischen Nachweis mit Indoxylacetat als Substrat konnte Esteraseaktivi-tät auf ungekeimten Konidien sowie an Infektionsstrukturen von U. necator lokalisiert wer-den. Nach Inokulation von Rebblättern mit Konidien wurde eine Sporenwaschlösung gewon-nen, in der mit p-Nitrophenylbutyrat als Substrat ebenfalls Esteraseaktivität nachgewiesen werden konnte. Die Enzymaktivitäten waren durch 100 µM der Serin-Esteraseinhibitoren DIPF und BIC zu 52 bzw. 77% hemmbar. Nach Trennung der Sporenproteine mit Hilfe nicht-denaturierender PAGE konnte ein Protein identifiziert werden, das durch Umsetzung von Indoxylacetat als Esterase charakterisiert wurde. Das aus dem Gel eluierte Protein zeigte in ei-nem Nachweis mit 3H-Cutin cutinolytische Aktivität, die durch 10 µM DIPF zu 72% inhibiert wurde. Eine Southern-Blot-Analyse mit restriktionsverdauter genomischer DNA von U. necator, Fusarium solani und Magnaporthe grisea deutet darauf hin, daß das Cutinase-Gen von U. necator möglicherweise keine Homologie mit den bisher sequenzierten Cutinasen aufweist. Das Vorkommen von Cutinasen ohne Homologie zu den oben genannten Cutinasen wurde bereits bei anderen phytopathogenen Pilzen unter parasitischen Bedingungen nachgewiesen.
In epidemiologischen Studien wurde die Entwicklungsgeschwindigkeit von U. necator in Abhängigkeit von der Temperatur und der Anfälligkeit des Wirtsgewebes untersucht. Als Maß für die Entwicklungsgeschwindigkeit von U. necator wurde die Dauer der Latenzperiode p unter kontrollierten Bedingungen auf der Ober- und Unterseite von Blattscheiben zweier Rebsorten bestimmt. In einem weiten Temperaturbereich von 17-28°C war das Wachstum des Pilzes optimal. Die Zeit von Inokulation bis zur neuerlichen Sporulation betrug in diesem Be-reich zwischen 5 und 10 Tagen. Maximale Latenzzeiten ergaben sich nach Inkubation bei 10°C (24-28 Tage). Auf der Blattoberseite der jeweiligen Rebsorte war die Latenzperiode ge-ringfügig kürzer als auf der Unterseite. Auch unter semikontrollierten Bedingungen auf Blät-tern von Topfreben war eine starke Beeinflussung der Entwicklung durch die Temperatur er-kennbar. Die Latenzperiode verkürzte sich in allen Varianten vom Frühjahr (12-18 d) bis zum Sommer (6-9 d) und verlängerte sich zum Ende der Vegetationsperiode wieder auf 10-14 d. Die Dauer der Latenzperiode war dabei nicht von der inokulierten Blattseite abhängig, jedoch von der Rebsorte. Kürzere Latenzzeiten ergaben sich auf cv. Müller-Thurgau.
Der Infektionserfolg war auf der Blattunterseite wesentlich höher als auf der Blattoberseite, ferner wurden Mycel und sporulierende Kolonien von U. necator häufiger auf cv. Müller-Thurgau als auf cv. Riesling gebildet.
Eine Simulation der Latenzperiode unter Verwendung der gemessenen Temperaturdaten ergab Werte für p, die in derselben Größenordnung wie die der tatsächlich gemessenen Latenzzeiten lagen.
In this study the morphology of early developmental stages of Uncinula necator (SCHW.) BURR., the causal agent of grapevine powdery mildew, on its host Vitis vinifera was investigated. The biochemical events that preceded the penetration of host epidermal cells were characterised. Based on earlier studies on artificial surfaces, penetration of cuticle and epi-dermal cell wall has been thought to be achieved mainly by mechanical forces. However, cuticle and cell-wall degrading enzymes like cutinase appear to be important for the success of powdery mildew fungi. Therefore, the role of these enzymes in the infection process was in-vestigated. During this period, where infection occurs, the different stages of development were defined and the time course of germination and adhesion of conidia was assessed.
The course of conidial germination was observed on leaf disks of V. vinifera at conditions equal to those in which esterase activity occurred (see below). At optimum temperature (24°C) a germ tube started to emerge from the apical end of the conidium earlier than 2 hpi, swell at its distal end and subsequently matured to a lobed primary appressorium (3.5 hpi). Concurrent with an increase of the germination rate, the portion of conidia with appressoria increased; within the first 10 h, 70 % of the spores had germinated and 50 % had formed appressoria. Subsequently, the number of germinated conidia remained constant. Occurrence of primary (14 hpi) and secondary hyphae (18 hpi) indicated colonisation of the leaf tissue. In parallel, adhesion assays showed that conidia are easily washed off from the leaf surface be-fore the onset of germination. Between 3 and 8 hpi the portion of adhering germlings increased form a base level of 15% to a saturation level of about 70%. Pretreatments of leaf material with the esterase inhibitor BIC did not result in reduction of adhesion.
As shown by a LTSEM study, the surface of germinating conidia of U. necator appeared to be covered by an additional layer of reticulate structure, while the surface of conidia attached to the conidiophore was smooth. At the contact zone of respectively the primary appressorium and the cuticle of grapevine and barley leaves depositions of an extracellular material were visible that remained on the host surface after the dislocation of spores. The occurrence of a matrix at a stage where fungal metabolism is restricted to nutrients from inside the spore suggests that this phenomenon plays an essential role in the infection process leading to a firm attachment of the penetration organ. Depositions were also observed on artificial surfaces like glass and PVDF membranes.
In histochemical assays with indoxylacetate as a substrate esterase activity was localised on ungerminated conidia and on infection structures of U. necator; and spore washing solutions containing esterase activity (p-nitrophenylbutyrate as a substrate) were obtained from inoculated grapevine leaves (4 hpi). Enzyme activity was inhibited by 52 and 72 % with 100 uM DIPF and BIC respectively. Spore proteins were further separated with non-denaturing PAGE, indoxylacetate-positive bands were excised and protein eluted. Proteins showed cutinolytic activity with 3H-cutin as a substrate. In assays containing 10 ?M DIPF inhibition was 72 %. A Southern blot analysis with restriction-digested genomic DNA of U necator, F. solani and M. grisea suggested that the cutinase gene of U. necator shares no similarities in nucleotide se-quence with cutinases of the serine-esterase-type. The existence of alternative cutinases under parasitic conditions has already been demonstrated in other plant-fungus interactions.
In studies on the epidemics of grapevine powdery mildew the dynamics of development depending on air temperature and susceptibility of the host was investigated. As a measure for the speed of development, the length of the latent period p of U. necator on upper and lower leaf surface of two cultivars of V. vinifera was determined. Growth of the fungus was at its optimum inside a broad temperature range (17-28°C) with values of p between 5 and 10 d. Maximum latency was obtained at 10°C (24-28 d). On the upper leaf side of the respective cultivar, the latent period was slightly shorter compared to the lower side. Under semicon-trolled conditions on leaves of cuttings, the strong effect of temperature on fungal develop-ment was also apparent. The latent period shortened from spring (12-18 d) until mid-summer and returned back to higher values at the end of the growing season (10-14 d). The duration of the latent period was dependent of the cultivar rather than of the leaf side inoculated. Shortest latencies were observed on cv. Müller-Thurgau.
The infection success was higher on the lower leaf side. In addition, mycelium and sporulating colonies of U. necator were found more frequently on cv. Müller-Thurgau than on cv. Riesling.
A simulation of the latent period using measured temperature data resulted in values of p which were in the same order of magnitude than the measured data.
Dans ce travail nous avons étudié, chez Vitis vinifera, la morphologie des premiers stades de développement díUncinula necator (SCHW.) BURR., le responsable de líoïdium de la vigne. Nous avons aussi caractérisé les propriétés biochimiques qui précèdent la pénétration dans les cellules hôtes. A la suite díétudes de pénétration sur des surfaces artificielles, on pensait jus-quíà présent que la pénétration de la cuticule et des parois de líépiderme était un phénomène purement mécanique. Cependant, il apparaît que les enzymes de dégradation de la cuticule et de la paroi, comme la cutinase, ont un rôle important pour la pathogénie díautres champignons responsables de líoïdium. Le rôle des enzymes de dégradation de la cutine comme les cutinases et les estérases dans les processus infectieux a donc été étudié. Pendant cette phase de développement nous avons enregistré le déroulement de líadhésion des conidies et des germes et l'avons mis en relation avec les différents stades de germination.
Nous avons suivi en fonction du temps la germination des conidies sur des morceaux de feuille de V. vinifera, dans les conditions correspondantes à líapparition díactivité estérase. A une température de 24°C, un tube germinatif commence à se bomber en moins de 2 hpi sur la spore, à síépaissir (2,75 hpi), puis à se développe en un appressorium lobé en 3,5 hpi. La pro-portion de conidies avec appressorium augmente parallèlement au taux de germination. En 10 h, 70% des spores ont germé et 50% des conidies ont formé un appressorium. Par la suite le nombre de conidies germées est resté constant. Líinvasion du tissu hôte commence avec líapparition des hyphes primaires (14 hpi) et secondaires (18 hpi). Des test díadhésion conduits parallèlement ont montré que les conidies pouvaient être facilement lessivées de la surface hôte avant le début de la germination. Entre 3 et 8 hpi la proportion de germes solide-ment ancrés passe de 15% à un niveau de saturation díenviron 70%. Un prétraitement des feuilles avec líinhibiteur díestérase BIC níentraîne aucune réduction significative de líadhésion.
Les études de cryo-microscopie électronique à balayage ont montré une structure réticulaire à la surface des conidies de U. necator en germination, alors que les conidies paraissent lisses lorsquíelles sont sur les conidiophores. On a pu observer des dépôts extracellulaires aux zones de contact entre les appressoriums primaires et les cuticules de V. vinifera ou de Hordeum vulgare, lesquels restent en partie sur la surface hôte même lorsque les spores sont parties. Líapparition de cette matrice à un stade où le métabolisme du champignon est limité par les réserves des spores, laisse à penser quíil síagit díune étape importante qui conduit à líancrage efficace de líorgane de pénétration sur la surface hôte. Ces dépôts síobservent également dans le cas de surfaces artificielles telles que le verre ou les membranes en PVDF.
Par histochimie nous avons pu localiser, avec de líacétate díindoxyle comme substrat, une activité estérase sur des conidies non germées ainsi que sur des structures infectieuses de U. necator. Après inoculation des feuilles de vigne avec des conidies, nous avons pu montrer avec du p-nitrophenylbutyrate comme substrat, une activité estérase dans la solution de lavage des spores. Cette activité enzymatique a pu être inhibée à respectivement 52 et 77% par 100 µM des inhibiteurs de sérine-estérase DIPF et BIC. Après séparation des protéines de spores par électrophorèse (PAGE) non-dénaturante, nous avons pu identifier une protéine qui a été caractérisée comme estérase par la transformation de líacétate díindoxyle. En utilisant de la cutine tritiée, nous avons montré que la protéine éluée du gel avait une activité cutinolytique qui pouvait être inhibée à 72% par 10 µM de DIPF. Une analyse en Southern-Blot après di-gestion de líADN génomique de U. necator, Fusarium solani et Magnaporthe grisea suggère quíil níy a sans doute pas díhomologie entre le gène de la cutinase de U. necator et les cutina-ses séquencées jusquíà présent. Líexistence de cutinase sans homologie avec les cutinases susnommées a déjà été montrée avec díautres champignons phytopathogènes dans des conditions parasitaires.
Des études épidémiologiques ont montré líinfluence de la température et de la sensibilité du tissu hôte sur la vitesse de développement de U. necator. Pour quantifier la vitesse de déve-loppement du champignon, nous avons utilisé la période de latence p en conditions contrôlées sur les faces supérieure et inférieure de deux cépages de vigne. Líoptimum de croissance pour le champignon se situe entre 17 et 28°C. Dans cette gamme de température le temps entre líinoculation et la sporulation suivante va de 5 à 10 jours. Les temps de latence maximum sont atteint avec une incubation à 10°C (24 à 28 jours). Le temps de latence sur la face supérieure des feuilles des différentes variétés de vigne est très légèrement plus court que sur la face infé-rieure. Cette influence de la température sur le développement du champignon est également visible sur les feuilles des ceps en pots en situation semi-contrôlée. Dans tous les cas la pé-riode de latence raccourci du printemps (12 à 18 jours) à líété (6 à 9 jours) et rallonge jusquíà la fin de la période de végétation (10 à 14 jours). Le temps de latence ne dépend pas de la face inoculée mais de la variété. Les temps de latence les plus courts sont observés avec le cépage Müller-Thurgau.
Líinfection est plus virulente sur la face inférieure que sur la face supérieure des feuilles, de plus, le mycelium et les colonies sporulantes de U. necator se forment plus souvent sur le cé-page Müller-Thurgau que sur le Riesling.
Une simulation des temps de latence en utilisant les données de température mesurées ont donné des valeurs de p du même ordre de grandeur que les temps de latence réellement mesurés.
[Traduit par C. & M. Couderchet, Reims]
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1st Edition 1999
Hartung-Gorre Verlag KonstanzISSN 0930-8105
ISBN 3-89649-420-1